Самое значительное собрание древних рукописей в мире. Библиотека основана папой Николаем V в XV в. и с тех пор постоянно пополняется. Помещения библиотеки украшают фрески и картины итальянских мастеров (в том числе Гвидо Рени), одну из стен занимает римская фреска эпохи Августа. Значительное пополнение собрания произошло в 1623 году, когда в Ватикан была передана богатейшая Библиотека Фуггеров из Гейдельберга. В настоящее время в библиотеке насчитывается примерно 60 тысяч манускриптов, 7 тысяч инкунабул, около миллиона печатных книг и более 100 тысяч гравюр и географических карт. Читальный зал располагается в Большом Сикстинском зале.